下调let-7微小RNA对卡波西肉瘤相关疱疹病毒裂解复制和丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4及其下游因子的影响

摘要：目的：探讨下调let?7微小RNA（ miRNA）的表达对卡波西肉瘤相关疱疹病毒（ KSHV）裂解复制的影响。方法采用miRNA海绵技术抑制let?7 miRNAs的表达，脂质体法将pEGFP?C2?let?7 sponge质粒转染到BCBL?1和293T细胞中。实时荧光定量PCR法检测let?7 miRNAs的表达，丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4（MAP4K4）、环氧合酶2（COX?2）和基质金属蛋白酶13（MMP?13） mRNA的表达以及KSHV开放读码框（ ORF）50和ORF72基因DNA复制水平。 Western blot法检测MAP4K4和COX?2蛋白的表达以及 p38丝裂原活化蛋白激酶、细胞外调节蛋白激酶（ ERK1／2）和c?Jun氨基末端激酶（ JNK）蛋白的表达及磷酸化水平。结果在BCBL?1细胞中，let?7 sponge组中let?7 miRNAs的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义（均P＜0．05）；在293T细胞中，let?7 sponge组中let?7a、let?7b、let?7c、let?7d、let?7e、let?7f、let?7g和let?7i的相对表达水平与空载体组比较，差异均有统计学意义（均 P＜0．05）。质粒转染 BCBL?1细胞48 h后，空载体组和 let?7 sponge组中KSHV ORF50 DNA的相对复制水平分别为1．00±0．10和2．33±0．18，差异有统计学意义（P＜0．001）；KSHV ORF50 mRNA的相对表达水平分别为1．08±0．48和3．22±0．27，差异有统计学意义（ P＜0．001）。空载体组和let?7 sponge组中 KSHV ORF72 DNA的相对复制水平分别为1．07±0．49和1．67±0．45， mRNA相对表达水平分别为1．01±0．19和1．54±0．11，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。转染质粒48 h后，空载体组和let?7 sponge组中 MAP4K4 mRNA的相对表达水平分别为1．00±0．05和5．73±0．96， COX?2 mRNA的相对表达水平分别为1．00±0．05和2．68±0．19，MMP?13 mRNA的相对表达水平分别为1．00±0．02和2．69±0．25，差异均有统计学意义（均 P＜0．001）。 let?7 sponge 组与空载体组比较， MAP4K4和COX?2的蛋白表达水平也明显提高。在 BCBL?1细胞中 let?7 miRNAs 的表达下调时， KSHV ORF50和 ORF72 mRNA 的表达水平增加， KSHV ORF50和 ORF72 DNA 的复制水平增加， MAP4K4、COX?2和MMP?13 mRNA的表达上调。在293T和BCBL?1细胞中，let?7 sponge组的ERK1／2磷酸化水平高于空载体组，但p38和JNK磷酸化水平无变化。结论抑制细胞let?7 miRNAs的表达可激活KSHV复制，其可能是通过上调其靶基因MAP4K4的表达，上调MAP4K4下游因子COX?2和MMP?13的表达水平及ERK1／2磷酸化水平来诱发KSHV的激活，终导致卡波西肉瘤的发生和发展。