ZR30蛋白靶向胶质瘤不同亚群细胞胞外信号蛋白发挥抑癌作用

摘要：目的 探讨人工合成的EFEMP1源性抑癌蛋白ZR30与表皮生长因子受体(EGFR)、Notch-1、Akt、基质金属蛋白酶2(MMP-2)的相关性及其对胶质瘤细胞生长、侵袭、血管生成和干性维持的影响,阐明ZR30的抑癌作用机制.方法 使用小麦胚芽无细胞系统合成体外蛋白ZR30.采用明胶酶谱法检测ZR30处理2～3 d后的U87和U251细胞中MMP-2的活性,Western blot检测ZR30处理2～3 d后的胶质瘤亚群细胞U251和U251NS中EGFR、p-Akt、Akt和Notch-1的表达.分别以10和50 ng／ml的ZR30处理U251细胞,以10、50和200 ng／ml的ZR30处理U251NS细胞,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测ZR30对 U251和 U251NS细胞增殖的影响.将 U251-GFP 和 U251NS-RFP 细胞混合(1 ∶ 9)后,注入裸鼠颅内,分别于10和21 d后瘤内注射ZR30或磷酸盐缓冲液(PBS).提取各组裸鼠右侧大脑的 DNA,采用荧光定量聚合酶链反应( CQ-PCR)检测人类基因 hSPAG16、鼠基因mSpag16、GFP和RFP的拷贝数.观察各组裸鼠的生存情况,进行生存分析.结果 10、50 和100 ng／ml ZR30处理2 d后,U87和U251细胞培养液中的活性MMP-2水平均低于对照组. Western blot检测显示,ZR30能抑制U251细胞中EGFR、Notch-1和p-Akt蛋白的表达,以及U251NS细胞中Notch-1和p-Akt蛋白的表达,并可降低U251细胞对表皮生长因子刺激的响应. MTT检测结果 显示,ZR30处理U251和U251NS细胞2 d后,能抑制细胞增殖. CQ-PCR结果 显示,PBS组、180 ng ZR30组、700 ng ZR30组和1 800 ng ZR30组裸鼠的hSPAG16／mSpag16比值分别为3.67±2.82、1.18±0.97、1.75±1.55和1.38±1.17,180 ng ZR30组、700 ng ZR30组和1 800 ng ZR30组与PBS组比较均降低(均P＜0.05);GFP／RFP比值分别为1.97±0.80、1.97±0.85、1.48±0.71和1.73±0.77,各组间差异均无统计学意义(均P＞0.05). U251-GFP与U251NS-RFP细胞混合液移植后10 d治疗,PBS组和ZR30组裸鼠的中位生存时间分别为40.5和59.0 d;移植后21 d治疗,PBS组和ZR30组裸鼠的中位生存时间分别为57.0和74.5 d. ZR30治疗组裸鼠生存时间均显著延长(均P＜0.05).结论 ZR30通过抑制胶质瘤细胞中活性MMP-2、EGFR、p-Akt／Akt和Notch-1的表达,抑制胶质瘤细胞的生长、侵袭、血管生成和干性维持,显著延长胶质瘤原位移植瘤裸鼠的生存时间,对胶质瘤有治疗潜能.